Ayúdanos a ayudarte: una placa ilegible es un problema que empezó tres días antes

Hay un tipo de placa que cualquier microbiólogo reconoce al instante. La sacas del incubador y sabes que no hay nada que hacer con ella. Crecimiento confluente de borde a borde; más de trescientas colonias amontonadas sin separación; hongos que han colonizado la placa tanto que han formado su propia Pangea, la cual delimita la extensión de cada colonia por una fina línea más oscura.

Esa placa no se puede contar. Ni a ojo, ni con lupa, ni con el mejor sistema de análisis de imagen que exista. Y la razón es el proceso de siembra e incubación.

Puede parecer una tontería, pero tendemos a pensar en el recuento como el momento crítico, el que requiere atención y criterio. Pero el recuento solo puede ser tan bueno como la placa que tiene delante. Una siembra mal planteada equivale a un mal resultado que es imposible de rescatar, una placa que no se diseñó para ser contada.

En este artículo hablaremos sobre eso mismo: cómo sembrar para que la placa resultante se pueda leer. No es un tema menor ni evidente. Es, probablemente, la parte del proceso donde más se decide la calidad del resultado final.

No todas las siembras sirven para contar

Antes de hablar de cómo sembrar bien para recuento, conviene aclarar algo que en la práctica genera más confusión de la que debería: no todas las técnicas de siembra están pensadas para contar. Cada una tiene un propósito distinto, y usar una para algo para lo que no fue diseñada es una fuente de problemas por sí sola.

La siembra por triple estría (o estría por agotamiento) tiene un objetivo muy concreto: aislar colonias individuales a partir de una mezcla, separando una cepa de otra o purificando un cultivo. El patrón en zigzag, con el asa flameada entre sectores, va reduciendo progresivamente la densidad de células hasta que en el último sector crecen colonias bien separadas que se pueden picar e identificar. Es una técnica de aislamiento, no de recuento. Las colonias que produce no son cuantificables porque la cantidad de inóculo depositada no es conocida ni reproducible. Una placa sembrada por estría no es una placa que se cuente — es una placa de la que se selecciona.

La siembra en superficie (spread plate / siembra por extensión) sí es una técnica de recuento. Se deposita un volumen conocido de muestra diluida, normalmente 0,1 mL, y se distribuye de forma homogénea sobre la superficie del agar con un asa de Drigalski o equivalente. Las colonias crecen en la superficie, donde son visibles, accesibles y fáciles de discriminar. Es la siembra de elección cuando se quiere contar microorganismos aerobios y cuando interesa que las colonias sean grandes y bien definidas.

La siembra en profundidad (pour plate / siembra por vertido) es la otra gran técnica de recuento. Se mezcla un volumen conocido de muestra con agar fundido y atemperado antes de que solidifique. Las colonias crecen tanto en la superficie como dentro de la masa de agar. Permite contar volúmenes de muestra algo mayores y es la base de la ISO 4833-1, pero tiene una contrapartida: las colonias internas son más pequeñas y a veces más difíciles de visualizar que las de superficie.

La siembra en césped (lawn plating) busca lo contrario al recuento: un crecimiento confluente y uniforme en toda la placa. Es la base de los antibiogramas por difusión en disco y del recuento de fagos por placas de lisis. Aquí el objetivo no es contar colonias, sino tener una capa continua sobre la que medir halos de inhibición o calar placas. Contar un césped no tiene sentido — no está hecho para eso.

Esta separación de propósitos está bien establecida en la literatura metodológica: la estría se describe para aislar colonias individuales, mientras que el vertido y la extensión se reservan para enumerar colonias viables, y los recubrimientos de agar blando para titular fagos (Sanders, 2012, Journal of Visualized Experiments). No son variantes intercambiables de una misma técnica, sino herramientas para problemas distintos.

La distinción importa porque determina qué placa tiene sentido llevar a un recuento y cuál no. Una placa de aislamiento por estría, una de césped o una contaminada no son placas de recuento fallidas: son placas que nunca tuvieron la intención de contarse. El recuento cuantitativo vive en la siembra en superficie y en profundidad sobre medio sólido. Todo lo demás resuelve otros problemas.

El error de las prisas

De todos los errores de siembra, hay uno que se comete más que ningún otro y que casi siempre tiene la misma causa: la impaciencia.

Después de extender el inóculo en superficie, hay que esperar a que se absorba completamente antes de invertir la placa para incubarla. Si se invierte cuando el inóculo todavía está húmedo, el líquido se desplaza por gravedad, arrastra las células hacia un lado y arruina la distribución uniforme que se acababa de conseguir. El resultado es una placa con colonias amontonadas en una zona y vacía en otra. Imposible de contar de forma representativa.

La espera es de unos dos minutos. Solo dos minutos. Pero cuesta sorprendentemente convencer a alguien con prisa de que merece la pena, porque dos minutos parados delante de la placa se sienten como tiempo perdido cuando hay cincuenta muestras esperando. No lo son. Es la diferencia entre una placa legible y una que habrá que repetir, y repetir cuesta bastante más de dos minutos.

Es el error de las prisas por excelencia, y la solución no es técnica. Es entender por qué la espera existe. Cuando se entiende que ese inóculo húmedo es líquido libre que se va a mover en cuanto inclines la placa, y con ello la distribución de la muestra.

Acertar la dilución antes de jugársela

El problema más frecuente detrás de una placa incontable, las más de trescientas colonias, el crecimiento confluente, es casi siempre el mismo: se sembró una dilución equivocada porque no se sabía la concentración de partida de la muestra.

Cuando se trabaja con una muestra de concentración desconocida, sembrar directamente una dilución y esperar a ver qué sale es jugársela. Si aciertas, perfecto. Si no, has gastado placa, medio, tiempo de incubación y muestra para acabar con algo que no se puede contar, y tienes que empezar de cero.

Hay formas de reducir ese riesgo. La más elegante que conozco es el método de Miles y Misra, que permite visualizar el gradiente de varias diluciones seriadas en una sola placa antes de comprometerse con una siembra completa. Descrito originalmente en 1938 como método para estimar el poder bactericida de la sangre, ha sobrevivido casi un siglo precisamente porque sus recuentos se ajustan con notable fidelidad a una distribución de Poisson, lo que lo hace estadísticamente sólido pese a su sencillez (Miles, Misra e Irwin, 1938, Journal of Hygiene). Se divide la placa en sectores, se deposita una gota pequeña (típicamente 20 µL) de cada dilución seriada en su sector, y se deja crecer. Al día siguiente, una de las diluciones habrá caído en la densidad óptima — colonias separadas y contables — y eso te dice exactamente qué dilución sembrar a placa completa para obtener un resultado dentro de rango.

Tiene un coste: requiere una noche de incubación previa, y la muestra tiene que aguantar refrigerada hasta entonces sin que su carga microbiana cambie de forma significativa. No siempre es viable. Pero cuando lo es, ahorra una cantidad enorme de placas desperdiciadas y de recuentos fallidos. A mí me ayudó muchísimo cuando empezaba, porque convierte la elección de la dilución en una decisión informada en lugar de una apuesta.

Cuando Miles y Misra no es práctico, la alternativa razonable es sembrar siempre dos o tres diluciones consecutivas en paralelo. Multiplica el número de placas, sí, pero garantiza que al menos una caiga dentro del rango contable, y evita la repetición completa del análisis tres días después. Entre gastar dos placas de más hoy y repetir todo el ensayo el viernes, la cuenta sale clara.

Sembrar pensando en quien va a contar

Una buena siembra para recuento no busca solo que crezca algo. Busca que lo que crezca sea fácil de leer. Y "fácil de leer" tiene requisitos concretos.

El primero es la densidad correcta: colonias suficientes para que el resultado sea estadísticamente representativo, pero no tantas que se toquen y se fusionen. El rango contable de la norma (15 a 300 colonias según ISO, 25 a 250 según otras guías) tiene un sentido. Es el objetivo de la siembra. Cuando siembras, estás intentando aterrizar dentro de ese rango. Todo lo que hagas con la dilución va dirigido a eso.

El segundo es la distribución uniforme. Una placa con colonias repartidas de forma homogénea se cuenta de un vistazo, se puede dividir en sectores si hace falta, y permite extrapolar con fiabilidad. Una placa con las colonias apelotonadas en un lado no es representativa aunque el número total esté en rango. La extensión homogénea del inóculo y la espera a que seque son lo que producen esa uniformidad.

El tercero es la separación entre colonias, y aquí hay un punto que se subestima. Las colonias que se tocan son un problema no solo para el ojo humano, sino especialmente para cualquier lectura por imagen. Cuando dos colonias se fusionan, ni un analista ni una cámara pueden saber con certeza si era una colonia grande o dos pequeñas pegadas. Con los hongos esto se vuelve crítico: un crecimiento fúngico excesivo, donde las colonias se han extendido hasta tocarse, no deja espacio para distinguir unidades individuales. La placa se vuelve ilegible no porque haya mucho, sino porque ya no hay fronteras entre las cosas.

Por eso una siembra pensada para recuento es, en el fondo, una siembra que respeta el espacio. Que apunta a una densidad donde cada colonia tiene sitio para crecer aislada de sus vecinas. Eso facilita el recuento, sea cual sea el método, porque todos dependen de lo mismo: poder trazar el borde de cada colonia sin ambigüedad.

Las condiciones de lectura ayudan, pero no rescatan. Una buena iluminación indirecta, un fondo de contraste adecuado y una placa limpia por debajo mejoran la lectura de una placa bien sembrada. No arreglan una mal sembrada. La luz no separa colonias que crecieron pegadas.

El recuento empieza en la siembra

Volviendo a la placa del principio, la confluente, la de los hongos tocándose, la de las trescientas colonias amontonadas.

El analista que la saca del incubador no cometió ningún error. El error ya estaba cometido. Estaba en la dilución que se eligió sin saber la concentración de partida, en el inóculo que se invirtió antes de secar, o en la falta de una siembra de tanteo que hubiera avisado de que esa muestra tenía mucha más carga de la esperada.

Esto es lo que quiero transmitir: el recuento no es un acto aislado al final del proceso. Es la última etapa de una cadena que empieza en la siembra, y la calidad del resultado se decide mucho antes de que nadie se siente a contar. Una placa bien sembrada casi se cuenta sola. Una mal sembrada no se cuenta de ninguna manera.

La próxima vez que una placa salga incontable, la pregunta útil no es "cómo la cuento". Es "qué pasó en la siembra". Casi siempre, la respuesta está ahí.

Referencias

• Miles, A.A., Misra, S.S. e Irwin, J.O. (1938). The estimation of the bactericidal power of the blood. Journal of Hygiene, 38(6), 732–749. — Descripción original del método de la gota para recuento de viables en superficie. https://doi.org/10.1017/S002217240001158X

• Sanders, E.R. (2012). Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments (JoVE). — Propósitos diferenciados de estría (aislamiento), vertido y extensión (enumeración) y recubrimiento de agar blando (titulación de fagos). https://doi.org/10.3791/3064

• ISO 4833-1:2013 y ISO 4833-2:2013. Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of microorganisms. International Organization for Standardization. — Técnicas de siembra en profundidad y superficie, rango contable. https://www.iso.org/standard/53728.html y https://www.iso.org/standard/59509.html